大鼠心肌细胞的方法及注意事项

　一．细胞介绍

　　B.KimesandB.Brandt从源于BD1X大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆了H9c2(2-1)细胞株，它表现许多骨骼肌的特性。这个细胞株中的成肌细胞能融合形成多核的肌管，并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%，融合发生得很快。

　　细胞名称：大鼠心肌细胞

　　智立编码：2021125910341725

　　来源：心脏

　　形态：成肌细胞，贴壁生长

　　含量：>1x106细胞数

　　规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　用途：仅供科研使用。

　　二．培养基及培养冻存条件准备

　　1）准备DMEM（含1.5g/LNaHCO3）培养基；胎牛血清，10%；双抗1%。

　　注意:该细胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/LNaHCO3）培养基培养细胞时需要提高CO2浓度（7%-10%）。

　　2)气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　三．细胞处理：

　　1）冻存细胞的复苏：

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

　　1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

　　3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　下面T25瓶为例；

　　1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

　　2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

　　四．运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。