人脑胶质瘤细胞的培养步骤

　　名称：T98G(人脑胶质瘤细胞)(STR鉴定正确)

       智立编码：20211259101548850

　　别称T98G;T-98G;T98G;T98-G

　　种属人类

　　年龄（性别）男性，61岁

　　组织来源脑组织

　　生长特性贴壁细胞

　　细胞形态成纤维细胞样

　　推荐传代比例1:3-1:5

　　推荐换液频率2~3次/周

　　倍增时间~28-40小时

　　冻存条件

　　冻存液：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO

　　温度：液氮

　　培养条件

　　气相：空气，95%；CO2，5%

　　温度：37℃

　　运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞接收后的处理

　　1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

　　2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

　　3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

　　4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议T25培养瓶1：2传代。

　　细胞培养步骤：

　　一、培养基及培养冻存条件准备：

　　1、培养液：DMEM(高糖)+10%FBS

　　2、培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3、冻存液：90%FBS+10%DMSO，现用现配。液氮储存。

　　二、细胞处理：

　　1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

　　2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

　　1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2）加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

　　3）按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

　　4）将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

　　3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1mlFBS后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

　　注意事项：

　　1.收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　2.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

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