H9胚胎干细胞培养步骤与方法！

细胞名称：H9

　　智立编码：20211259102012360

　　细胞描述：人胚胎干细胞，曾用名WA09

　　形态：球形克隆，贴壁生长

　　来源性别：女性

　　组织：内细胞团

　　冻存日期/代数：详见冻存管/培养瓶标识

　　建议复苏培养体系：1个T25培养瓶或6cm培养皿

　　细胞状态：良好

　　支原体检测结果：阴性

　　细胞用途：仅供科研使用。

　　培养流程

　　复苏

　　在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好，已确保尽快完成复苏过程。

　　1.将冻存管从液氮中取出，在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管，70%乙醇擦拭进行消毒。

　　2.使用移液管将冻存管中含有H9细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中，过程轻柔防止吹散细胞团。

　　3.室温300g离心5min。

　　4.吸出培养基，确保细胞团完整。

　　5.然后缓慢加入1mL完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。

　　6.轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据终培养细胞的液体体积，加入ROCKinhibitorY27632，终浓度为10μM。

　　7.将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

　　传代

　　当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

　　1.传代前，准备37℃预热好的好无钙镁PBS溶液及消化液，完全培养基。

　　2.吸走上清，并加入37℃预热好的PBS溶液清洗1次。

　　3.加入适量（按6孔板每孔加1ml，6cm皿加2ml，10cm皿加3ml的量）的37℃预热好的消化液。

　　4.37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

　　5.加入适量的完全培养基终止消化。

　　6.移入离心管，300g离心5min，

　　7.离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

　　8.传代比例为1：6—1：8，根据终培养细胞的液体体积，加入ROCKinhibitorY27632，终浓度为10μM。

　　9.将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

　　2.3.冻存

　　当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

　　1.传代前，准备37℃预热好的好无钙镁PBS溶液及消化液，完全培养基。

　　2.吸走上清，并加入37℃预热好的PBS溶液清洗1次。

　　3.加入适量（按6孔板每孔加1ml，6cm皿加2ml，10cm皿加3ml的量）的37℃预热好的消化液。

　　4.37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

　　5.加入适量的完全培养基终止消化。

　　6.移入离心管，300g离心5min。

　　7.离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

　　8.使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按6孔板每孔冻1支，6cm皿冻2-4支，10cm皿冻6-12支（冻存液为：90%H9细胞完全培养基与10%的DMSO。

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