质粒RP4

载体基本信息

　　载体名称:RP4

　　智立编码：202112410362442836

　　生长条件：37°C

　　生物安全等级:1级

　　宿主菌:

　　载体类型:

　　复制子:

　　抗性:氨苄、卡那、四环素

　　启动子:

　　建议宿主菌:

　　载体大小（kb）:60.8

　　多克隆位点:否

扩增流程

收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必先转化提质粒后使用）

①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μlddH2O去离子水溶解质粒；

②取1支100μl感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；

④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；

（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另外不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）

⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）

四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）

穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）

直接挑取单菌落至液体培养基中。

5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）

单提取的液体质粒收到后可直接使用。

6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，保质期90天，请务必先转化提质粒后使用）

收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。